Η θητεία του Ζαχαρία Παπαντωνίου διακόπηκε από το θάνατό του τον Φεβρουάριο του 1940. Δύο μήνες αργότερα τη διεύθυνση της Πινακοθήκης ανέλαβε ο ζωγράφος και συντηρητής Γεώργιος Στρατηγός (1876-1944), του οποίου η θητεία επίσης διακόπηκε από το θάνατό του τον Νοέμβριο του 1944. Από τις 26 Αυγούστου 1945 διευθυντής ανέλαβε προσωρινά ο αρχαιολόγος Δημήτριος Ευαγγελίδης (1886-1959), παραμένοντας στη θέση αυτή ως τις 28 Φεβρουαρίου 1947. Την 1η Μαρτίου 1947 τον διαδέχθηκε ο αρχαιολόγος και ιστορικός τέχνης Νικόλαος Μπέρτος (1885-1949), η θητεία του οποίου επίσης διακόπηκε από το θάνατό του στις 11 Ιανουαρίου 1949.

Στη διάρκεια του πολέμου και της Κατοχής προτεραιότητα υπήρξε η ασφαλής φύλαξη των έργων, τα οποία είχαν μεταφερθεί στο Αρχαιολογικό Μουσείο και, τα πιο πολύτιμα, στο θησαυροφυλάκιο της Τράπεζας της Ελλάδος. Εν τω μεταξύ, από τον Ιανουάριο του 1941, η Πινακοθήκη είχε αναγκαστεί να εγκαταλείψει το κεντρικό κτήριο του Πολυτεχνείου λόγω επιτάξεως για την εγκατάσταση Στρατιωτικού Νοσοκομείου τραυματιών και για τη χρησιμοποίησή του, στη συνέχεια, από το στρατό κατοχής. Αμέσως μετά το Πολυτεχνείο κατέλαβε και πάλι τους χώρους του, με την αιτιολογία ότι είχε αυξηθεί ο αριθμός των σπουδαστών του και είχαν δημιουργηθεί νέες ανάγκες διδασκαλίας. Έτσι, η Πινακοθήκη έκανε προσωρινά έδρα της το Μουσείο Μπενάκη, ενώ ακολούθησαν διαδοχικές μεταστεγάσεις στην Casa d’Italia και το Αρχαιολογικό Μουσείο, όπου το 1948 μεταφέρθηκαν και τα έργα.

Η υποτυπώδης λειτουργία του μουσείου τη δεκαετία του 1940 δεν επέτρεψε παρά ένα στοιχειώδη εμπλουτισμό της συλλογής ζωγραφικής. Παρόλα αυτά, το 1946 η Πινακοθήκη δέχτηκε μια πολύ γενναιόδωρη προσφορά. Ο Οδυσσέας Φωκάς, επιμελητής (συντηρητής) από το 1915, κληροδότησε με τη διαθήκη του την κινητή και ακίνητη περιουσία του, «διά να πλουτίζεται με τα εισοδήματα το διεθνές τμήμα της νεωτέρας τέχνης». Με την κληροδοσία αυτή ο Φωκάς αναδείχθηκε στο δεύτερο μεγάλο ευεργέτη μετά τον Αλέξανδρο Σούτζο.

Επιπλέον, μετά την Απελευθέρωση, πραγματοποιήθηκε μια σημαντική δωρεά έργων Γάλλων καλλιτεχνών – τιμητική προσφορά προς τον ελληνικό λαό σε ένδειξη σεβασμού για την ηρωική του στάση στη διάρκεια της γερμανικής κατοχής – που ως ιδέα είχε ξεκινήσει από το 1942 με πρωτοβουλία του συγγραφέα και διανοούμενου Roger Milliex και της συντρόφου του, Τατιάνας Γκρίτση-Milliex. Περιλαμβάνει είκοσι οκτώ πίνακες ζωγραφικής, έξι σχέδια, έξι χαρακτικά, τέσσερα γλυπτά και δύο βιβλία, που παραδόθηκαν στην Εθνική Πινακοθήκη τον Ιούλιο του 1949.